Giới thiệu chung

Phản ứng Real time PCR hay còn được gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR),kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích.

Quy trình thí nghiệm theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi, trong đó đặc điểm chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện trong thời gian thực (real time). Đây là phương pháp tiếp cận mới so với phản ứng PCR thông thường-khi mà sản phẩm chỉ được xác định khi phản ứng đã kết thúc. Hai phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng đó là: (1) các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đôi nào đó, và (2) các đầu dò DNA đặc hiệu có chứa các đoạn oligonucleotide đã được đánh dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai giữa đầu dò với một trình tự bổ sung với nó, nhằm định lượng được RNA thông tin (mRNA) và các RNA không mã hóa trong các tế bào cũng như các mô.

Các thông tin tối thiểu cho các thí nghiệm PCR định lượng theo thời gian thực (MIQE) hướng dẫn rằng kí hiệu viết tắt qPCR được sử dụng cho PCR định lượng theo thời gian thật và RT-qPCR được sử dụng trong qPCR phiên mã ngược. Chữ viết tắt “RT-PCR” thường muốn nói đến phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược và không phải là PCR theo thời gian thực, tuy vậy không phải tất cả các tác giả tán thành với quy ước này.

1. Các nguyên lý cơ bản

PCR định lượng được thực hiên trong một máy gia nhiệt có khả năng chiếu sáng mỗi một mẫu với một chùmánh sáng có chiều dài bước sóng nhất định và xác định được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các phân tử huỳnh quang bị kích hoạt. Máy gia nhiệt cũng có khả năng làm nóng và làm lạnh các mẫu nhanh, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho các đặc điểm  lý-hóa của axit nucleic và enzyme DNA polymerase.

Quy trình PCR thường bao gồm các bước thay đổi nhiệt độ và các bước này được lặp lại 25-50 lần. Các chu trình này bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đầu tiên ở nhiệt độ vào khoảng 950C cho phép các axit nucleic ở dạng mạch đôi tách rời nhau thành các mạch đơn, giai đoạn thứ hai ở nhiệt độ từ 50-600C cho phép sự gắn kết của các mồi với khuôn DNA, giai đoạn thứ ba ở nhiệt độ từ 68-720C , tạo điều kiện cho phản ứng trùng hợp được xúc tác bởi enzyme DNA polymerase. Do các đoạn có kích thước nhỏ, bước cuối cùng thường được bỏ qua trong phản ứng PCR kiểu này bởi vì enzyme có khả năng làm tăng số lượng bản sao trong quá trình chuyển đổi giữa giai đoạn gắn kết và giai đoạn biến tính. Hơn nữa, một số máy gia nhiệt thêm vào một pha ngắn với nhiệt độ là 800C kéo dài khoảng vài giây đối với mỗi một chu kỳ, mục đích là để làm giảm các tín hiệu nhiễu gây ra bởi sự có mặt của các mồi tự bắt cặp khi sử dụng các chất nhuộm không đặc hiệu. Nhiệt độ và thời gian sử dụng đối với mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ như: loại enzyme dùng để tổng hợp chuỗi DNA, nồng độ của các ion và dNTPs trong phản ứng cũng như nhiệt độ nóng chảy của mồi.

2. Các ứng dụng của kĩ thuật qPCR

Có rất nhiều ứng dụng của kĩ thuật phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng trong các phòng thí nghiệm. Kĩ thuật này được sử dụng phổ biến trong cả chẩn đoán và nghiên cứu cơ bản. Trong công nghiệp, kĩ thuật này được sử dụng để định lượng các vi sinh vật có trong thức ăn và rau, hoặc sử dụng để xác định các sinh vật biến đổi gen và định lượng-xác định kiểu gen các virut gây bệnh ở người.

• Ứng dụng trong chẩn đoán

PCR định lượng được sử dụng trong việc phát hiện nhanh các axit nuleic có ý nghĩa chẩn đoán, ví dụ như các căn bệnh truyền nhiễm, ung thư và các bất thường di truyền. Việc xuất hiện của PCR định lượng ở các phòng thí nghiệm vi sinh vật học lâm sàng đã thúc đẩy mạnh mẽ việc chẩn đoán của các bệnh truyền nhiễm, kĩ thuật này cũng đã được mở rộng như một công cụ để phát hiện các căn bệnh mới nổi lên gần đây như: các chủng cúm mới hoặc là các kiểm tra với mục đích chẩn đoán.

• Ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh vật học

PCR định lượng được sử dụng bởi các nhà vi sinh vật học làm việc trong các lĩnh vực về an toàn thực phẩm, hư hỏng thực phẩm và lên men. Đồng thời kĩ thuật này cũng được sử dụng nhằm đánh giá nguy cơ nhiễm khuẩn của nguồn nước (nước uống và nước tái tạo) cũng như trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Thí nghiệm kháng khuẩn đếm khuẩn lạc (Virtual Colony Count) ứng dụng một kĩ thuật định lượng có tên: Động học sinh trưởng định lượng (QGK), phương pháp này giống qPCR về mặt toán học, ngoại trừ việc sử dụng các tế bào vi khuẩn thay vì các bản sao của sản phẩm PCR. Kĩ thuật này hiện nay đã được sử dụng rộng rãi. QGK tương ứng của chu kỳ giới hạn-khi bắt đầu phát hiện tín hiệu huỳnh quang được gọi là “thời gian giới hạn”.

• Ứng dụng trong nghiên cứu

Trong nghiên cứu, PCR định lượng được sử dụng với mục đích chính là định lượng số bản phiên mã của gen. Công nghệ này có thể được sử dụng trong việc phát hiện sự biến đổi trong biểu hiện của một gen qua thời gian, ví dụ như phản ứng của mô hoặc tế bào được nuôi cấy đối với một nhân tố có tính dược học, tiến trình biệt hóa tế bào, hoặc phản ứng đối với sự thay đổi của điều kiện môi trường. PCR định lượng đồng thời cũng được sử dụng trong việc xác định sự đồng nhất giữa các alen ở động vật biến đổi gen được sử dụng trong nghiên cứu.

• Xác định các tác nhân gây bệnh ở thực vật

Ngành nông nghiệp hiện nay đang hết sức cố gắng để tạo ra các chồi mầm hoặc các giống cây con hoàn toàn không bị nhiễm bệnh, nhằm bảo vệ sức khỏe và tránh thiệt hại về mặt kinh tế. Các hệ thống đã được phát triển với mục đích cho phép phát hiện chỉ một lượng nhỏ DNA của Phytophthora ramorum, đây là một loại nấm có thể giết chết Oaks và một số loài khác, DNA của loại nấm này kết hợp với DNA của thực vật chủ. Việc phân biệt DNA của mầm bệnh và thực vật dựa trên quá trình khuếch đại các trình tự ITS, đây là vùng trình tự thuộc phần gen mã hóa của RNA ribosome, và trình tự này là đặc thù cho từng đơn vị phân loại. Các phiên bản của kĩ thuật này đã được phát triển để xác định cùng một loại mầm bệnh.

• Xác định các sinh vật biến đổi gen

qPCR sử dụng quá trình phiên mã ngược (RT-qPCR) được ứng dụng để xác định các sinh vật biến đổi gen, cho thấy kĩ thuật này có độ nhạy và khả năng ứng dụng rộng rãi trong xác định DNA. Các phương pháp thay thế khác như phân tích DNA hoặc protein thường có độ nhạy kém hơn. Các mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại không chỉ riêng gen bị biến đổi mà còn là vùng điều khiển (promoter), vùng kết thúc (terminator) hoặc thậm chí các trình tự kết nối được sử dụng trong quá trình thiết kế vector. Vì quy trình tạo thực vật biến đổi gen thường dẫn tới việc thêm vào nhiều hơn một bản sao của gen bị biến đổi, do vậy mà số lượng gen chuyển cũng thường được đánh giá. Việc này được thực hiện bởi phép định lượng tương đốisử dụng một gen đối chứng ở đối tượng bị chuyển gen, và gen này chỉ có duy nhất một bản sao.

• Định lượng lâm sàng và kiểm tra kiểu gen

Các virut xuất hiện ở người thường do nhiễm khuẩn trực tiếp hoặc đồng nhiễm khuẩn. Điều này khiến cho việc chẩn đoán trở nên khó khăn khi sử dụng các kĩ thuật truyền thống, đồng thời dẫn tới tiên lượng bệnh và điều trị sai. Sự có mặt của qPCR cho phép cùng lúc định lượng và kiểm tra kiểu gen của một virut, ví dụ như virut viêm gan B-Hepatitis B Virus. Mức độ nhiễm được định lượng bằng số bản sao của hẹ gen virut trên một đơn vị. Mức độ nhiễm này khá liên quan trong nhiều trường hợp, ví dụ như khả năng virut herpes loại 1 tái kích hoạt có liên quan tới số lượng các nơ ron thần kinh bị nhiễm nằm trong hạch. Sự định lượng này được tiến hành sử dụng phiên mã ngược hoặc không, lý do là vì các virut xâm nhập vào hệ gen của người tại bất kì thời điểm nào trong chu trình sống. Một ví dụ là trường hợp virut gây bệnh ở đường sinh dục (HPV), khi mà một số biến thể của nó có liên quan tới sự xuất hiện của ung thư cổ tử cung.